實時熒光定量PCR技術基本原理詳解

　　01.導讀PCR是1984年開始出現的一項基因檢測技術，由于PCR技術具有簡便易行、敏感度高等優點，該技術被廣泛應用于基礎研究和臨床檢測，成為分子生物學必要的研究工具。傳統的PCR定量是應用終點PCR來對樣品中的模板量進行定量，通常用凝膠電泳分離，并用熒光染色來檢測PCR反應的終擴增產物。但在PCR反應中，由于反應體系和反應條件等因素會影響PCR反應效率,甚至出現一些非特異性擴增產物。因此，用終點PCR法來定量并不準確。

　　實時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新的定量技術，該技術克服了PCR法進入平臺期后定量的較大誤差問題,實現DNA/RNA的精確定量，而且具有敏感度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術在醫學臨床檢驗及臨床醫學研究方面都有著重要的意義。

　　02.基本原理：在PCR反應過程中，每經過一個循環,PCR產物量增加.相應的熒光信號強度也跟著增加,此時收集一個熒光強度信號。經過若干個循環后，可以得到一條以循環數(cyclethreshold,CT)為橫坐標和熒光強度(△Rn)變化為縱坐標的“S"形熒光擴增曲線。

　　我們將這條熒光擴增曲線人為地分為背景期、指數擴增期和平臺期三個階段:

　　①背景期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所覆蓋，我們無法判斷熒光強度的變化。

　　②指數擴增期，熒光信號呈指數增長，擴增產物的量與起始模板量存在線性關系，在此階段可定量分析。

　　③平臺期，由于底物耗盡等因素.熒光信號不再呈指數增加。

　　重要的概念：實時熒光定量PCR技術中有幾個重要的概念，包括擴增曲線、基線、熒光閾值和域值循環數。圖片。

　　（1）擴增曲線（amplificationcurve）:是在實時熒光定量PCR中監測到的熒光信號隨著循環數變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應過程中，通過檢測系統對PCR管內的樣品進行實時檢測，將熒光信號值通過成像技術顯現在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期、指數增長期、線性增長期、平臺期。

　　（2）基線（baseline）：是背景曲線的一段，在擴增反應的初數個循環里熒光信號變化不大，接近一條直線。

　　（3）熒光閾值（threshold）:是在熒光擴增曲線指數增長期設定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產物量的標準）。熒光閾值可以設定在PCR擴增的指數期。

　　（4）閾值循環數:表示每個PCR反應管內熒光信號達到設定的熒光閾值所經歷的循環數，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，即起始拷貝數越多，CT值越小;起始拷貝數越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數的標準品可做出以起始拷貝數的對數為橫坐標,CT值為縱坐標的一條標準曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標準曲線上計算出該模板的起始拷貝數。

　　03.反應體系

　　反應體系和條件

　　（1）模板濃度與純度:模板的初始濃度越低，結果的重復性越差。初始濃度越高，超出了反應體系的線性范圍，則需要對模板進行稀釋，否則隨著底物的過早耗盡，可能出現假陰性結果。如果待測模板的濃度處于PCR反應體系的檢出限附近.則需要檢測雙份以保證結果的可靠性

　　（2）酶及其濃度:TaqDNA聚合酶有兩種，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶：另一種是從大腸埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應需要2.5U的酶。濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

　　（3）Mg2+的濃度:Mg2+對PCR擴增的特異性和產物有顯著影響。Mg2+的濃度過高，會增加引物二聚體的形成；Mg2+的濃度過低，會降低TaqDNA聚合酶的活性。