實時熒光定量PCR的原理及應用

　　實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光集團，利用熒光信號來實時監測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。

　　其特點有：

　　(1)用產生熒光信號的指示劑顯示擴增產物的量，進行實時動態連續的熒光監測，避免終點定量的不準確性，并且消除了標本和產物的污染，且無復雜的產物后續處理過程。

　　(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Real-timeO-PCR可以應用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數的檢測、單核苷酸多態性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監測。

　　實時熒光定量PCR技術的基本原理

　　在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監測整個PCR進程，在PCR循環中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標。并且引入一個——Ct值（Thresholdcycle）概念，Ct值是指產生可被檢測到得熒光信號所需的小循環數，是在PCR循環過程中熒光信號由本底開始進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。

　　熒光閾值相當于基線熒光信號的平均信號標準偏差的10倍。一般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來產生標準曲線，然后計算相對方程式。

　　方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關系數（R²＞0.99），這樣才能認為實驗的過程和數據是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。

　　實時熒光定量PCR技術的應用

　　1.基因工程研究領域

　　①基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數據。

　　②轉基因研究：利用兩種發光探針及適當的循環閾值，擴增一個轉移后的基因和一個對照基因，以分析轉基因老鼠接合性。該方法為45個轉基因動物的同型結合及異質結合提供了明確的鑒定結果。通過實時定量PCR檢測，同型結合的異質接合動物交配后其子代中轉基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規律。這項技術在轉基因動物繁育及基因劑量功能效應實驗中將有很大的用途。

　　③單核苷酸多態性（SNP）及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩定性。基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便*配對，如有突變，則探針與靶序列不*配對，會降低雜交體得穩定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態性進行分析。

　　2.醫學研究領域

　　①病原體檢測：由于實時熒光定量PCR方法可靠性和重復性好，并且操作簡便、快速、結果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關病原體核酸量與感染性疾病發生、發展和預后之間關系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。

　　②藥物療效考核：利用實時熒光定量PCR技術檢測臨床樣品中與抗藥性相關的基因的表達。結果證明，實時熒光定量PCR系統是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應用這種技術可以預測化療將引起的反應。

　　③腫瘤基因檢測：腫瘤的本質是細胞內基因發生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現。熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。

　　3.其他領域

　　用實時熒光定量PCR方法對免疫組分進行分析是其應用的重要方面。